Při hledání nových možností pro tvorbu účinných probiotik s cílem omezit poodstavové průjmy selat představuje trávicí trakt zdravých prasat ideální zdroj. V rámci této studie byl ze střevního obsahu divokých prasat izolován, identifikován a podrobně charakterizován obsáhlý soubor kmenů bakterií mléčného kvašení. Šest kandidátů s nejvhodnějšími probiotickými vlastnostmi bylo využito pro konstrukci probiotické směsi pro selata po odstavu a otestováno v experimentálních podmínkách po infekci enterotoxigenním kmenem Escherichia coli.
ÚVOD
Průjmová onemocnění selat po odstavu představují závažný problém v chovatelské praxi a jsou zodpovědná za více než desetiprocentní ztráty v této věkové kategorii prasat. Omezení využití antibiotik a od roku 2022 i zákaz používání oxidu zinečnatého v medikační dávce k prevenci průjmových onemocnění u selat po odstavu vede chovatele k nezbytnosti hledání nových, ekonomicky schůdných, ale zároveň účinných strategií pro kontrolu těchto onemocnění v chovech. Jednu z možných alternativ představuje použití probiotik, tedy preparátů obsahujících živé mikroorganismy (bakterie či kvasinky), které, jsou-li podávány v dostatečném množství, přispívají ke zlepšení zdravotního stavu hostitele. Probiotika pozitivně ovlivňují složení střevní mikroflóry, omezují kolonizací střeva patogeny či snižují míru vylučování patogenů, mírní klinické příznaky onemocnění a zvyšují imunitní odezvu organismu.1
Významnou žádoucí vlastností probiotických kmenů je jejich schopnost adherovat na epitel a mukózní vrstvu střeva hostitele, chránit jeho trávicí trakt před infekcí. V neposlední řadě je výhodnou probiotickou vlastností schopnost bakterií rozkládat hůře utilizovatelné oligo- a polysacharidy zejména rostlinného původu, což u hospodářských zvířat může vést k lepší stravitelnosti krmiv.6
MATERIÁL A METODY
Izolace a identifikace bakterií mléčného kvašení
V průběhu let 2019 a 2020 byly odebrány vzorky obsahu trávicího traktu (tenkého či tlustého střeva) od celkem 83 kusů divokých prasat a 67 kusů domácích prasat (obrázek 1). Vzorky byly bezprostředně po odběru transportovány v anaerobních podmínkách do laboratoře a do 24 hodin po odběru vysety souběžně na vybrané selektivní půdy pro kultivaci bakterií mléčného kvašení (BMK). Takto byla získána sbírka obsahující přibližně 1400 izolátů BMK původem z trávicího traktu divokých a domácích prasat. Pro další charakteristiky bylo vybráno přibližně 60 izolátů BMK, které byly dále testovány s ohledem na jejich schopnost. Z vybraných izolátů byla purifikována celková genomová DNA.
Konstrukce probiotické krmné směsi
Na základě podrobných fyziologických, biochemických a molekulárně biologických charakteristik bylo do probiotické kompozice vybráno šest vhodných kmenů BMK (izoláty označené jako M477A, M494A, M587A, M65A, M624A a M51A) s potenciálně probiotickými účinky. Kmeny byly uchovávány při teplotě –80 °C v mrazicím boxu a rozmrazeny bezprostředně před aplikací selatům v rámci experimentu. V kombinaci s probiotickou kompozicí BMK bylo rovněž během experimentu testováno i inovované krmivo typu „starter“ (Pig Starter Premium) navržené společností Mikrop Čebín, a. s., určené pro selata po odstavu. Toto krmivo bylo suplementováno legislativně schválenými aditivy pro odstavená selata podporující správný vývoj gastrointestinálního traktu, jako je například přídavek organických kyselin či řasy Chlorella vulgaris. Jako kontrolní krmivo byl použit starter Pig Starter Super (Mikrop Čebín a. s.) bez výše uvedených aditiv.
Experimentální zvířata a design pokusu
Během experimentu bylo použito celkem 40 selat obou pohlaví po odstavu ve věku 28 dní. Zvířata pocházela z konvenčního chovu, při zahájení experimentu nevykazovala žádné klinické známky onemocnění a byla kultivačně negativní na přítomnost salmonel a E. coli. Selata byla náhodně rozdělena do čtyř skupin po deseti kusech a individuálně označena. Prvních 14 dní trvání experimentu byly dvě pokusné skupiny selat adlibitně krmeny inovovanou krmnou směsí Pig Starter Premium a dvě kontrolní skupiny selat byly po stejnou dobu adlibitně krmeny krmnou směsí Pig Starter Super. Pátý den po aklimatizaci zvířat a zahájení podávání probiotické směsi v krmivu byla všechna selata perorálně infikována suspenzí enterotoxigenního kmene Escherichia coli (ETEC) v dávce 1 x 109 CFU (obrázek 2). Pro infekci byl použit klinický izolát ETEC. Následných 14 dní pokusu byla selata ve všech čtyřech skupinách adlibitně krmena krmivem typu „časný odstav selat“ (ČOS, Mikrop Čebín a. s.). Denní dávka krmiva pro jednu pokusnou a jednu kontrolní skupinu zvířat byla obohacena o 1 x 109 kolonie tvořících jednotek (CFU) testované probiotické kompozice bakterií mléčného kvašení a selatům byla podávána každý den nepřetržitě po celou dobu trvání experimentu. Zvířata byla 28. den experimentu utracena vykrvením v celkové anestezii a poté byl proveden odběr vzorků střevních obsahů na bakteriologické vyšetření.
Detekce E. coli ve výkalech
Ve dnech 2, 4, 7, 9, 16 a 23 po infekci byly všem selatům odebrány vzorky výkalů pro stanovení míry vylučování ETEC.
VÝSLEDKY
Klinický stav zvířat
Průměrná tělesná teplota ve všech čtyřech experimentálních skupinách se pohybovala v rozmezí hodnot 39,5 °C a 40,4 °C bez ohledu na podávané krmivo či suplementaci probiotickými kmeny BMK po celou dobu trvání pokusu. Zvířata ve všech skupinách během pokusu nevykazovala známky změn klinického stavu, s výjimkou spíše individuálně se vyskytujícího průjmu ve všech experimentálních skupinách v průběhu prvních sedmi dnů po experimentální infekci.
Během celého experimentu se průměrné hmotnostní přírůstky u všech čtyř experimentálních skupin ve dnech 7, 14, 21 a 28 trvání pokusu lišily vzájemně nejvýše o 0,5 kg (graf 1).
Vylučování E. coli výkaly
ETEC byla vylučována výkaly u selat ve všech experimentálních skupinách v nejvyšší míře druhý den po infekci a v průběhu experimentu postupně počty vylučované ETEC u všech skupin klesaly (graf 3). Nejnižší průměrné hodnoty logaritmu počtů ETEC vylučované výkaly byly zaznamenány po celou dobu trvání pokusu u skupiny selat, kterým byl podáván starter Pig Starter Premium v kombinaci s probiotickými kmeny. Od devátého dne po infekci až do ukončení pokusu vykazovala signifikantně nejvyšší průměrné hodnoty logaritmu počtů ETEC vylučované ve výkalech pokusná skupina selat, které byl podáván kontrolní starter (Pig Starter Super) bez přídavku probiotické směsi.
DISKUSE A ZÁVĚR
Vzhledem k nezbytnosti hledat nová řešení v profylaxi i terapii poodstavových průjmu u prasat představují nově získané, dosud nevyužívané kmeny bakterií s probiotickými vlastnostmi, zejména bakterie mléčného kvašení, vhodnou alternativu. Jedním z vhodných zdrojů, odkud lze získávat nové izoláty s žádoucími vlastnostmi, je střevo zdravých prasat. Divoká prasata žijí v přirozených podmínkách, bez použití krmných aditiv, léčiv, antibiotik či probiotik, která jsou používána v chovech domácích prasat. Střevní mikroflóra divokých prasat, zejména mladých jedinců, proto obsahuje ve srovnání s domácími prasaty jiné spektrum mikroorganismů, které mohou představovat ideální rezervoár nových probiotických bakterií.9,10
V rámci této studie bylo izolováno a identifikováno přibližně 1400 izolátů bakterií mléčného kvašení původem z trávicího traktu divokých a domácích prasat. Pro podrobnou charakterizaci bylo vybráno 60 zástupců tak, aby pokryli co nejširší spektrum druhů z různých lokalit a zdrojů. Na základě zjištěných charakteristik bylo vybráno šest izolátů s vhodnými probiotickými vlastnostmi.
Hodnoty konverze krmiva se v prvním týdnu experimentu mezi skupinami významně lišily bez ohledu na podávaný typ starteru či suplementaci probiotickými kmeny. Rozdíly hodnot konverze krmiva mezi skupinami byly sedmý den pokusu ovlivněny pravděpodobně spíše akutně probíhající infekcí, která byla sedmý den experimentu detekovatelná nejvyššími hodnotami.
Míra vylučování ETEC výkaly po experimentální infekci selat po odstavu byla v průběhu experimentu ovlivněna typem podávaného starteru. Obě experimentální skupiny selat, které byly v průběhu prvních 14 dnů po odstavu krmeny inovovaným krmivem Pig Starter Premium, vykazovaly druhý den po infekci nižší hodnoty počtů ETEC.
Synbiotická směs tvořená šesti podrobně charakterizovanými kmeny bakterií mléčného kvašení původem z trávicího traktu divokých prasat tak inovovaným krmivem typu starter je schopna snižovat míru infekce enteropatogenní Escherichia coli u selat po odstavu a zkracuje dobu vylučování ETEC výkaly. Takto navržená směs krmiva a probiotických bakterií představuje možnost, jak efektivně přispět k omezení poodstavových průjmů v chovech selat a její potenciál s ohledem na technologické zpracování a případné využití v praxi bude dále testován.
Spoluautoři z Výzkumného ústavu
veterinárního lékařství, v. v. i.:
Mgr. Magdaléna Crhánová, Ph.D.
MVDr. Kateřina Kavanová
Ing. Iveta Kostovová, Ph.D.
Mgr. Monika Morávková, Ph.D.
Poděkování
Tato práce vznikla za podpory projektu NAZV QK1910351 a institucionální podpory Ministerstva zemědělství RO0523.
Literatura
1. PEREIRA, WA., FRANCO, S. M., REIS, I. L., MENDONÇA, C. M. N., PIAZENTIN, A. C. M., AZEVEDO, P. O. S., TSE, M. L. P., DE MARTINIS, E. C. P., GIERUS, M., OLIVEIRA, R. P. S. Beneficial effects of probiotics on the pig production cycle: An overview of clinical impacts and performance. Vet Microbiol. 2022;269:109431.
2. FUOCHI, V., PETRONIO, G. P., LISSANDRELLO, E., FURNERI, P. M. Evaluation of resistance to low pH and bile salts of human Lactobacillus spp. isolates. Int J Immunopathol Pharmacol. 2015;28(3):426-33.
3. RUIZ, L., MARGOLLES, A., SÁNCHEZ, B. Bile resistance mechanisms in Lactobacillus and Bifidobacterium. Front Microbiol. 2013;4:396.
4. MUSCARIELLO, L., DE SIENA, B., MARASCO, R. Lactobacillus cell surface proteins involved in interaction with mucus and extracellular matrix components. Curr Microbiol. 2020;77(12):3831-3841.
5. YOUNAS, S., MAZHAR, B., LIAQAT, I., ALI, S., TAHIR, H. M., ALI, N. M. Bacteriocin production by lactobacilli and their role as antibacterial tool against common pathogens. J Oleo Sci. 2022;71(4):541-550.
6. LIAO, S. F., NYACHOTI, M. Using probiotics to improve swine gut health and nutrient utilization. Anim Nutr. 2017;3(4):331-343.
7. EGERVÄRN, M., DANIELSEN, M., ROOS, S., LINDMARK, H., LINDGREN, S. Antibiotic susceptibility profiles of Lactobacillus reuteri and Lactobacillus fermentum. J Food Prot. 2007;70(2):412-8.
8. MORÁVKOVÁ M., KOSTOVOVÁ I., KAVANOVÁ K., BRYCHTA A. Divoká prasata jako zdroj probiotických bakterií pro prasata domácí. Náš Chov. 2022;2.
9. LI, M., WANG, Y., CUI, H., LI, Y., SUN, Y., QIU, H.J. Characterization of lactic acid bacteria isolated from the gastrointestinal tract of a wild boar as potential probiotics. Front Vet Sci. 2020;7:49.
10. ZHONG, Y., FU, D., DENG, Z., TANG, W., MAO, J., ZHU, T., ZHANG, Y., LIU, J., WANG, H. Lactic acid bacteria mixture isolated from wild pig alleviated the gut inflammation of mice challenged by Escherichia coli. Front Immunol. 2022;13:822754.
11. KLOSE, V., BAYER, K., KERN, C., GOELß, F., FIBI, S., WEGL, G. Antibiotic resistances of intestinal lactobacilli isolated from wild boars. Vet Microbiol. 2014;168(1):240-4.
12. OJHA, A. K., SHAH, N. P., MISHRA, V. Conjugal transfer of antibiotic resistances in Lactobacillus spp. Curr Microbiol. 2021;78(8):2839-2849.
13. ONYANGO, S. O., JUMA, J., DE PAEPE, K., VAN DE WIELE, T. Oral and gut microbial carbohydrate-active enzymes landscape in health and disease. Front Microbiol. 2021;12:653448.
14. CREUS, E., PÉREZ, J. F., PERALTA, B., BAUCELLS, F., MATEU, E. Effect of acidified feed on the prevalence of Salmonella in market-age pigs. Zoonoses Public Health. 2007;54(8):314-9.
15. MARTINS, C. F., TREVISI, P., COELHO, D. F., CORREA, F., RIBEIRO, D. M., ALFAIA, C. M., PINHO, M., PESTANA, J. M., MOURATO, M. P., ALMEIDA, A. M., FONTES, C. M. G. A., FREIRE, J. P. B., PRATES, J. A. M. Influence of Chlorella vulgaris on growth, digestibility and gut morphology and microbiota of weaned piglet. Sci Rep. 2022;12(1):6012.
